Research progress and prospect of decellularized matrix in kidney tissue engineering

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.019

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have demonstrated that the well combination of decellularized matrix and appropriate seeded cells could construct a tissue-engineered kidney.
OBJECTIVE: To review advances in kidney tissue engineering and decellularized matrix.
METHODS: The first author retrieved CNKI, Wanfang and PubMed databases for articles addressing kidney tissue engineering published from January 1996 to April 2016. The key words were “decellularized matrix, extracellular matrix, tissue engineering, kidney, seeded cells” in English and Chinese, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: The decellularized matrix loses its immunogenicity due to the removal of cellular
components, while it retains the important bioactive components of the extracellular matrix and the ultrastructure of the tissues and organs, making it more and more important in kidney tissue engineering. The decellularized matrix especially exerts an important role in the tissue-engineered construction of the entire kidney as driven by recently emerging all-organ acellular cell technology. Remarkable advances in kidney tissue engineering and decellularized matrix have been made in recent years, and realized the construction of a certain functional tissue-engineered kidney. However, there are still many challenges on the way to construct a completely functional tissue-engineered kidney.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Kidney, Extracellular Matrix, Tissue Engineering

CLC Number:

R318

Shen Jiang-wei, Zhou Liu-hua, Jia Rui-peng, Liu Jun. Research progress and prospect of decellularized matrix in kidney tissue engineering[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(10): 1589-1595.

Figures/Tables 1

2.1 脱细胞基质与肾脏组织工程研究 2.1.1 脱细胞基质及其制备方法、评价标准脱细胞基质主要是采用物理和/或化学等方法去除组织/器官的细胞成分，同时保留其组织构架、生物活性成分及生物力学特征而得到的细胞外基质成分。肾脏细胞外基质是肾脏细胞在其生长的微环境下合成并分泌到细胞外的，主要由葡萄糖胺聚糖、弹性蛋白、胶原蛋白(主要有Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原等)、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等交织而成的网络结构[13-14]。嵌入在细胞外基质中的可溶性因子如生长因子、细胞因子和趋化因子等，对细胞的存活、增殖、迁移和分化等生物学行为有一定的调控作用[15-16]。肾脏细胞外基质是一种动态变化的结构，在肾脏不同的层面其分子组成也有差别，其成分分布也具有一定区域特异性。如层粘连蛋白和Ⅳ型胶原在肾小球和肾小管的沉积模式不同。在成人中，Ⅳ型胶原是由α链(α1-α6)构成的三聚体，层粘连蛋白是由3种类型的层粘连蛋白链(α，β，γ)组成的层粘连蛋白三聚体(12种)。而由α3、α4、α5三聚体组成的Ⅳ型胶原和由α5β2γ1三聚体组成的层粘连蛋白在成人仅分布于肾小球基底膜。表明这两种特定形式的Ⅳ型胶原和层粘连蛋白在肾小球的滤过功能中发挥着重要作用。另外，Ⅳ型胶原的α1、α1、α2三聚体及其他类型的层粘连蛋白三聚体，存在于肾小管且不出现在肾小球基底膜上[13]。肾脏细胞外基质在体内的转化主要受基质金属蛋白酶及其抑制剂调控，细胞外基质合成与降解之间的平衡点是维持肾脏正常功能的基础，如果细胞外基质合成与降解之间发展不平衡将会引起肾脏产生一些病理状态，如熟知的肾脏细胞外基质过度堆积会引起肾脏的纤维化[17-18]。目前，脱细胞基质常用的制备方法见表1，可应用其中的一种方法或结合多种方法进行组织/器官脱细胞基质的制备[19-20]。尽管脱细胞基质的制备方案不同，但在其制备过程中一方面要尽可能完全去除其中的细胞成分，以便减轻或消除脱细胞基质材料移植入机体后可能发生宿主免疫排斥反应或者炎症反应或引发细胞毒性反应；另一方面，要尽可能保留有益于种子细胞生物学行为的细胞外基质成分及其超微结构。因此，脱细胞基质材料的检测和评估尤为重要。其检测的主要内容有：①脱细胞基质材料中细胞其成分的检测：脱细胞基质材料中细胞成分的残留是引起宿主移植物排斥反应或炎症反应或细胞毒性反应的根源，因此理想的生物支架材料需要将其细胞成分(目前主要检测的是残留DNA成分)降低到一定阈值，且在这个阈值以下，较少或不引起相关不良反应。尽管，目前对残留DNA成分的安全性评价尚无完全统一的标准，但可通过定量或定性等方法检测。如：采用苏木精-伊红染色或DAPI荧光染色可对脱细胞基质材料中的核酸成分进行初步的定性检测。此外，也可对脱细胞基质材料采用提取其中总的DNA成分进行(分光光度或荧光)定量分析。Crapo等[19]推荐的采用DAPI荧光染色或H&E染色定性联合定量法来直观的评价其细胞去除的程度，脱细胞后的组织参考标准有：每mg干组织中dsDNA含量< 50 ng；DNA碎片的长度应该< 200 bp；DAPI或苏木精-伊红染色的切片看不到明显的核酸着色；②细胞外基质成分保留情况检测：尽管细胞外基质在组成成分上有一定差异，但其主要成分基本一致，如不同类型的胶原蛋白、葡萄糖氨基葡聚糖、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白和一些生长因子等。这些成分的保留对种子细胞发挥其生物学行为有重要作用，因此，脱细胞基质材料必须含有这些重要组成成分。这些成分的检测可采用组织形态学、蛋白电泳、酶联免疫吸附试验等方法进行定性或定量检测[21-22]；③脉管结构及其力学性能检测：脱细胞基质材料，尤其是全器官脱细胞基质材料，能够较好的保留组织器官的脉管网络结构是这种支架材料的一大优势，这也有望解决组织工程中面临的一大难题—工程化材料的血管化问题。肾脏脱细胞后能够较好的保留其脉管系统，扫描电镜或微型CT均能较好的显示出其保留情况[21-22]。生物力学方面特性可通过脉管支架结构压力测试进行评估[23]；④支架材料的生物相容性检测：脱细胞基质材料的最终目的是与种子细胞完美组合构建功能性工程化组织器官，实现其对体内病理性组织器官的功能性替代，这就要求脱细胞基质材料对种子细胞和机体均无毒副反应，无毒性及刺激作用，也就是说一定要具有较好的生物相容性。脱细胞基质的生物相容性可通过在其上面培养种子细胞查看种子细胞的生长情况、移植入体内查看机体内的反应情况、溶血试验、热原试验等方法来检测[24-25]。 2.1.2 不同脱细胞方案的选择尽管脱细胞的方法多种多样，其最终目的都是为了获得较为适用的肾脏脱细胞基质支架材料，但是在脱细胞基质支架材料的制备中受到很多因素的影响，如脱细胞制剂的浓度、脱细胞过程中周围环境的温度、pH值、有无联合其他脱细胞制剂/方法等。因此，为获得最优化的肾脏脱细胞基质的制备方案，研究者也进行了一系列的探索。在肾脏脱细胞基质制备中，离子型去污剂SDS是一种较为常用的脱细胞制剂[21-22，26-29]。Bonandrini等[21]单独应用离子型去污剂SDS灌注制备大鼠全肾脏脱细胞基质，透射和扫描电镜检查显示全肾脏脱细胞支架保留了血管、肾小球、肾小管的三维结构，微CT扫描进一步确认了血管网络结构的完整性。苏木精-伊红染色确认了细胞成分被完全去除，免疫组织化学染色显示脱细胞基质材料较好地保留了层粘连蛋白、纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原成分。Sullivan等[22]在猪肾脏脱细胞基质的制备中，通过对比0.5%SDS、0.25%SDS和1%Triton三种脱细胞方案，结果发现0.5%SDS在去除细胞成分方面效果最好，CT扫描显示这种方案还保留了完整的肾脏微血管网络体系结构，组织学和定量分析显示还保留了细胞外基质中的葡萄糖氨基葡聚糖和胶原蛋白成分，进一步研究发现，SDS制备的脱细胞基质材料对人原始肾脏细胞无毒副作用。Wang等[26]研究发现，与1%Triton X-100、1%过氧乙酸及1%脱氧胆酸钠相比，1%SDS组在猪肾脏脱细胞基质的制备中使得DNA残留最少，脱细胞效果及保留细胞外基质的成分(葡萄糖氨基葡聚糖)最好，而其他3种脱细胞方案却不能完全去除肾脏细胞成分。同时，经特殊染色和免疫组织化学还发现Triton X-100和1%脱氧胆酸钠组对细胞外基质的超微结构有一定破坏。尽管灌注SDS在脱细胞方面显示了很好优势，但也有研究发现当SDS浓度超过0.04%时，可使细胞外基质成分中的胶原结构变性并能去除细胞外基质中细胞生长需要的成分[30-31]。为了减少SDS的暴露时间，一些研究者采用联合其他方法的制备方案[25，32]。如Poornejad等[32]改进了脱细胞制备方案，采用机械压力控制灌注离子型去污剂SDS，联合渗透休克和反复冻融的方法，将SDS的暴露时间缩短到5 h左右，使得细胞外基质成分中的胶原和年多糖等成分的保留增加，使得脱细胞基质材料更有利于种子细胞的生长。也有研究者对反复冻融进行研究，发现这种方法可导致弹性纤维和胶原纤维等结构蛋白的损伤，但这项研究中也发现反复冻融对已制备好的脱细胞基质材料无明显影响[33]。非离子型去污剂Triton为另一种较为常用的脱细胞制剂，在肾脏脱细胞基质的制备中常与离子型去污剂SDS或其他脱细胞制剂联合[34-35]，如Caralt等[34]对比了1%Triton X-100、1%Triton X-100/0.1%SDS和胰蛋白酶/0.05%EGTA/1%Triton X-100三种方案的脱细胞效果及细胞外基质成分保留的情况，结果发现1%Triton X-100/0.1%SDS方案在保留肾脏微结构及含有生物因子碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子的基质成分方面更有优势。这项研究中还发现胰蛋白酶可以破坏肾脏微结构并使生长因子的丢失。另外，也有研究者对不同环境温度下脱细胞效果进行了研究，如Nakayama等[36]通过对比同一温度下不同脱细胞制剂(SDS和Triton)的去细胞效果，以及不同温度条件下同一脱细胞制剂的去细胞效果，结果发现，4 ℃条件下SDS去细胞效果最好并能较好地保留其天然结构。有些研究为了能更好的去除核酸成分还联合应用DNA酶[22，28]。关于在脱细胞基质制备中最优pH值的选择，研究者发现在pH为8时制备出的肺脱细胞基质微结构保留最好，并且这种pH值下制备的肺免疫原性最低[37]，然而，肾脏脱细胞基质制备中的最优pH值尚没有文献报道。 2.2 肾脏脱细胞基质的制备 2.2.1 部分肾脏(横向切片)脱细胞基质的制备部分肾脏(横向切片)脱细胞基质的制备主要是横向将肾脏切成若干个2.0-3.0 mm的薄层切片，然后将其浸泡在脱细胞制剂中，过程中联合搅拌/震荡以促进脱细胞过程的进展。如Nakayama等[36]将恒河猴肾脏薄层切片浸泡在离子型去污剂SDS和非离子型去污剂中Trion-100中制备脱细胞基质，过程联合震荡的方法，通过苏木精-伊红染色确认完全去除细胞成分；免疫组织化学检测证明保留了纤连蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原等细胞外基质蛋白；生物力学检测发现脱细胞基质支架的压缩系数较新鲜肾脏下降；经过进一步蛋白组学分析显示，细胞外基质支架还保留了生长因子蛋白和抗微生物蛋白及应激蛋白和补体成分[38]。他们的团队又更进一步研究发现，这种脱细胞基质材料能够促进人胚胎干细胞向肾脏细胞的分化[38-39]，尽管这种方法能够制备出较为适用于种子细胞生长、分化的支架材料，但在移植入体内进行肾脏替代方面仍有一定的缺陷，因此，全器官脱细胞基质的制备受到了更多研究者关注。 2.2.2 全肾脏脱细胞基质的制备自2008年Ott等[40]首先报道大鼠全心脏的脱细胞基质后，研究者也逐渐开始了全肾脏脱细胞基质的研究，并进行了一系列的相关实验。许多研究者主要用体积较小的啮齿类动物来制备肾脏脱细胞基质，研究结果也符合肾脏脱细胞基质成分的标准，为其进行再细胞化和体内移植提供了结构基础[25，29，41]。肾脏组织工程研究的最终目的是要构建功能性工程化肾脏并实现其对无功能人肾脏的替代。因此，啮齿类动物的肾脏很难实现其向临床的转化。为解决这一问题，一些研究者将关注点放在了体积较大动物肾脏的脱细胞基质。猪源性肾脏脱细胞基质材料的主要优势有：肾脏与人肾脏大小相似，处理过程中发生感染的风险较小，并且来源相对安全，这一点已经被临床应用的猪源性心脏瓣膜和小肠下黏膜的脱细胞基质材料证实[42-43]。为了验证制备猪源性肾脏支架的可行性，Bonandrini[22，44]团队开发了一种可有效的去除细胞成分的脱细胞技术，结果显示脱细胞的肾脏不仅去除了细胞成分，还保留了完整组织脉管系统的微观结构和重要的细胞外基质成分。相似的，也有一些研究者通过不同的脱细胞方案制备猪源性肾脏脱细胞基质支架[26，45]。最近也有一些研究者企图用人废弃的肾脏作为脱细胞支架的来源，所谓废弃肾脏主要指那些获取后用于移植但由于某些疾病如肾小球纤维化、肾小管萎缩、间质纤维化、炎症、皮质萎缩、血管变异等而废弃的人肾脏[46]。Orlando团队[44]经过既往的研究已掌握了成熟的脱细胞技术，为了制备一种可进一步向临床转化应用的脱细胞基质支架材料，他们将这种技术应用于人废弃肾脏，制备人源性肾脏脱细胞基质支架材料[47]。经扫描电镜检查，低倍放大后的图像显示肾小球毛细血管网也保留较完整，且毛细血管壁完整且没有细胞成分；高倍放大后的扫描电镜下可见排列规律无细胞成分肾小球基底膜和复杂的入球小动脉的血管极，另外，肾小囊内侧壁亦无上皮细胞被覆；脱细胞后的细胞外基质横切面可见肾小体内肾小管、小动脉网等组成的复杂蜂巢样结构。进一步证实了人废弃肾脏的细胞成分被完全去除，同时保留了肾小球、肾小管、各级血管的三维结构。经免疫染色显示脱细胞基质材料完全去除了组织相容性复合体HLA-ABC和HLA-D，使得这种脱细胞基质材料失去了免疫原性，从而有利于其体内移植。免疫组织化学检测证实，脱细胞基质材料保留了肾小球基底膜的Ⅳ型胶原，还保留了可促进种子细胞黏附于支架结构的Lamininα5。鸡胚绒毛尿囊膜试验证实这种脱细胞基质材料具有促进血管生成作用，此外，经过血管压力测试，这种脱细胞基质材料仍保留有一定的弹性收缩力，这将有利于后续的(种子细胞、血液等)灌注。后来Peloso等[28]研究发现，人来源肾脏脱细胞脱细胞基质不仅能够较好地保留肾脏内部超微结构，还能保留包括如血管内皮生长因子家族、转化生长因子家族在内的40种重要的生长因子，这些生长因子与血管化、肾脏发育、再生及糖代谢等重要生物学过程有关。这些研究说明人废弃的肾脏是制备肾脏脱细胞基质支架合适的来源，将它们应用于组织工程化肾脏的构建可能会比动物源性的更具有临床适用性。尽管应用人废弃肾脏看似引人注目的方法，但将其应用与临床，仍需要考虑一些问题，如大多数这些废弃肾脏来源于患有疾病或者老年人，可能会有一些病理性改变如，可能会有血管结构的变异和/或细胞外基质成分的改变。人废弃肾脏脱细胞基质向临床转化的应用仍需要进一步的安全性及可行性评估。 2.3 组织工程化肾脏的构建肾脏脱细胞基质材料制备的最终目的是与种子细胞一起构建功能性组织工程化肾脏，并实现对其功能的体内替代。组织工程化肾脏的构建与其他工程化组织/器官的构建相同，需要将支架材料与合适的种子细胞和/或生物因子完美的结合。近年来，许多研究者已经着手于工程化肾脏的构建，如Ross等[48]将种子细胞经肾动脉灌注移植于脱细胞基质材料上，结果显示有一部分干细胞可向内皮细胞分化，但遗憾的是他们未对肾小管样结构形成以及肾功能重建方面的检测；Song等[41]为了构建功能性工程化肾脏，改进了种子细胞的种植方法，将合适的种子细胞经肾动脉和输尿管同时输注移植于脱细胞基质材料上，经过3-5 d的生物反应器内培养，经检测形成血管内皮和肾小管上皮样结构，体内外实验表明，再生的肾脏具有部分的滤过大分子物质、重吸收糖和电解质的功能，表明重建了内皮细胞、足突状细胞和肾小管上皮细胞的功能；最近，Abolbashari等[27]将猪原始肾脏细胞种植于猪的肾脏脱细胞基质材料上，经组织学和免疫组化分析显示，再植后的种子细胞可形成能表达正常肾小管表面标志的肾小管样结构。进一步对其功能研究发现，这种工程化肾脏具有重吸收钠离子和蛋白质的功能，另外，还有水解酶活性并能够产生促红细胞生成素。说明这种工程化肾脏已基本具有了肾脏功能。但遗憾的是，他们并没有对再细胞化的肾脏进行体内移植，进一步验证这种工程化肾脏在体内能否发挥正常的肾功能。 2.4 肾脏组织工程中面临的一些挑战性问题尽管有许多研究者在基于肾脏脱细胞基质的肾脏组织工程中进行了很多探索，也取得了很大进展，但在功能性组织工程化肾脏的构建中仍面临着一些挑战性问题。第一，如何高效优质的制备脱细胞基质材料。尽管研究者们采用多种方案均能制备出符合标准需要的脱细胞基质材料，但随着其暴露时间的延长，其中的细胞外基质成分会有一定的降解减少，进而有可能会影响到再植细胞的生物学行为。因此，在保证质量的同时，高效也变得尤为重要。如：Guan等[29]简化了脱细胞基质的制备方案后，将SDS暴露时间缩短至4 h，获得了较为满意的结果，但这项研究总时间约为28 h。Poornejad等[32]通过联合多种脱细胞方法来改进制备方案，将SDS暴露的时间缩短至 5 h，总时间约为12 h。这也许会提供一种优化方案的思路。第二，如何实现脱细胞基质材料的完全再细胞化。脱基质材料的完全再细胞化对其功能的发挥尤为重要。Guan等[23]研究发现将肾脏脱细胞基质支架材料移植到体内，发现2周后支架内血液流动消失，经证实肾脏动、静脉内均形成了巨大血栓。为促进血管内皮的再细胞化，有研究者将CD31抗体包被于脱细胞基质材料上，这种方法促进了内皮细胞的停留和黏附，进而提高了脱细胞基质材料再细胞化的程度[49]。Song等[41]研究者为了提高再细胞化的程度，将内皮细胞经肾动脉灌注，同时将新生大鼠肾脏上皮细胞经输尿管灌注，经培养后证实有新生血管和肾小管样结构形成，移植到体内后能发挥一定的功能。也有研究者采用细针多点注射移植细胞的方法来提高种子细胞的再植效果[50]，根据既往关于干细胞治疗方面的经验，认为这种方案用于脱细胞基质材料中种子细胞的移植操作繁琐，另外也可能会对支架结构有一定的破坏，但是在干细胞治疗方面有一定的优势[51]。第三，如何实现工程化肾脏在体内长时间的移植。目前关于工程化肾脏在体内替代的研究大多移植时间很短(1.0-2.0 h)，暂时没有数据证明其体内长时间替代的可行性。构建组织工程化肾脏的最终目的是实现体内长时间的功能替代，因此，以后也应该加强对工程化肾脏在体内长时间替代的研究。 "

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